1927年，他一直在研究葡萄球菌的特性，当他在几周后回到实验室(经常不整洁)，惊讶地发现其中一个培养物被一种真菌污染，紧靠真菌的葡萄球菌菌群被破坏，而其他较远的葡萄球菌群则正常。1929年3月7日，他将这种霉菌鉴定为青霉菌属，并在几个月后称其为 “霉菌汁"，将其释放的物质命名为青霉素。
弗莱明后来说：
"当我在1928年9月28日黎明之后醒来时，我当然没有打算通过发现世界上第一种抗生素，或者说细菌杀手，来革新所有的医学，但我想这正是我所做的。”
资料来源：亚历山大-弗莱明爵士 亚历山大-弗莱明爵士
另见。青霉素的发现 &003